Thème 3:

Nos analyses des oeufs de Beroe (Houliston et al, 1993 , Development 117, 75-87.) et de xénope (Péréz-Mongiovi et al, 1998, J. Cell Sci.111, 385-393) pendant la période mitotique ont montré que des vagues de réorganisation de surface (SCWs) sont liées à une activation localisée de MPF.

MOVIES : Les Vagues à la première mitose chez Beroe coincident en temps et en espace avec l'etablissement de l'axe unique oral-aborale. Chez le xénope ils participent à la localisation progressive du plasme germinatif vers le pole végétatif de l'embryon (voici deux  exemples, 500Ko et 18Mo )

Chez le xénope, une vague d'activation de MPF due à une déphosphorylation de la kinase Cdc2 parcourt l'œuf fécondé du pôle animal vers le pôle végétatif en parallèle avec les SCW. Les SCW sont probablement provoquées localement par l'activation de MPF car la microinjection locale de MPF provoque des vagues ectopiques de réorganisation (Péréz-Mongiovi et al, 2000;  MOVIE). Dans le cadre d'une collaboration avec le laboratoire de C. Ford (Université de Sussex) nous avons examiné le rôle du noyau et de l'aster spermatique dans l'activation locale de MPF (Pérez-Mongiovi et al, 2000). La comparaison de la cinétique d'activation du MPF dans des fragments d'œufs contenant différentes combinaisons de structures ont indiqué que le noyau et les microtubules astraux participent à l'activation du MPF. De plus, nous avons pu recréer la stimulation de l'activation du MPF par le complexe noyau-centrosome in vitro dans les extraits oscyclants (préparés par centrifugation d'oeufs à basse vitesse) (Pérez-Mongiovi et al, 2000). L'activation localisée du MPF due au noyau et à l'aster pourrait constituer un mécanisme général destiné à créer ou à renforcer les asymétries durant le développement précoce dans de nombreuses espèces (Beckhelling et al, 2000).

Afin de comprendre l’origine du signal déclencheur de l’activation MPF nous avons procédé au fractionnement des extraits cytoplasmiques par centrifugation. Cette démarche a abouti à la découverte d’une association entre le pré-MPF et les structures de l’enveloppe nucléaire (Beckhelling et al, 2003). Cette découverte était issue des analyses d’une fraction produite par des centrifugations successives d’extraits d’œufs en prophase, nommée "UHSP" (pour Ultra High Speed Pellet), nécessaire à l’activation et l’inactivation du MPF. En utilisant différentes techniques de microscopie électronique, nous avons trouvé dans le UHSP des membranes empilées, fortement enrichies en pores nucléaires, des « lamelles  annelés » (LA). Les LA réprésentent une sous-population du RE avec des caractéristiques similaires à la membrane nucléaire. En accord avec la présence des LA dans cette fraction, notre caractérisation moléculaire a révélé la présence des protéines du RE ainsi qu’un fort enrichissement en protéines des pores nucléaires. Plus surprenant, nous avons aussi identifié dans le UHSP le MPF et son activateur Cdc25, dans leurs formes inactives. En parallèle avec leur activation à l’entrée en mitose, ils étaient libérés dans la fraction soluble. Ces observations ont suggéré l’hypothèse que le pré-MPF et ses régulateurs s’associent aux membranes nucléaires avant la mitose.
Cette association faciliterait l’activation de MPF localement et expliquerait l’action stimulatrice du noyau sur le MPF. Nous avons pu confirmer cette hypothèse par deux techniques de microscopie appliquées aux ovocytes de Xenopus, naturellement arrêtés en prophase de méiose 1. D’une part, nous avons pu mettre en évidence par immunofluorescence une co-localisation d’une partie du pré-MPF (détecté par un anticorps anti-cycline B2) et des LAs (détectées par un anticorps qui reconnaît des protéines spécifiques du pore nucléaire). D’autre part, nous avons détecté dans les ovocytes vivants par microscopie confocale la localisation au niveau des LA d’une protéine chimérique cyclinB2-GFP, exprimée à partir des ARNms micro injectés.

En parallèle avec les études sur le Xenopus, nous avons commencé les études sur les œufs de Clytia.  Par  différentes techniques de microscopous avons caractérisé des réorganisations équivalentes aux SCW et qui coincident avec l’entrée et la sortie de la mitose. MOVIE (5MB) d'un oeuf don le RE est marqué avec du DiI.
Nous avons aussi établi les conditions pour exprimer la cycline B fluorescente (YFP) à partir des ARN synthétiques injectés dans les œufs. De façon très satisfaisantes, nous avons pu suivre avec cet outil les relocalisations succesives du MPF au cours du cycle cellulaire chez Clytia (MOVIE: 9MB).